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体外细胞毒性试验

浏览次数:97|来源:飞凡检测 | 2021-04-26 09:34:39

飞凡检测可依据GB/T 16886.5进行体外细胞毒性试验测试,报告具有CMA/CNAS资质全球认可。咨询热线:18018131362

        试验步骤:

基本步骤

L929细胞接种到96孔板上,在培养中保持24小时(1倍周期) ,直到形成一个半收敛的单分子层(见参考文献。[5]了解更多有关细胞维持和培养程序的资料)。然后与一系列浓度测试化合物接触。暴露24小时后,测定各实验浓度,并与对照细胞比较。每个试验浓度计算生长抑制百分率。

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材料:L929细胞(NCTC克隆929:CCL1 1,美国类型培养物保藏中心[ATCC],美国弗吉尼亚州马纳卡斯)用作细胞系。ECACC编号88102702,欧洲细胞培养物保藏中心,SP40JG,萨尔茨堡,英国),并且细胞培养物应不含支原体。

准备:

培养基,

MTT法溶液:MTT溶液进行新鲜知识溶于其中不含酚红的MEM中,浓度为1mg/ml。溶液可以采用这种注射压力过滤器,经无菌过滤法除菌,溶液宜当天我们使用。

样品提取物的制备: 按 iso 10993-12标准制备样品提取物

方法:

检验质量检验1:阳性对照和阴性对照

试验质量检查2:空白

试验步骤:

注意:贮存细胞进行解冻后,细胞在用于临床试验研究之前要传代2次~3次

在冻存细胞继代培养后的第一天

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酶驱动的消化(trypsin/EDTA)用于从培养瓶中取出培养细胞,细胞悬浮在200克离心3分钟。       咨询热线:18018131362

细胞密度调整至1105细胞/毫升。用多通道移液管在96孔组织培养微板的孔中外侧加入100l 培养基。[附录 e ]) ,在剩余的孔中中,加入100l 细胞悬液,密度为1105细胞/ml (= 1104细胞/孔)。细胞培养24小时(5% co2,37 ° c,> 90% 湿度)形成半融合单层。在这个疾病潜伏期期间,细胞被修复并附着在指数增长上。在相差显微镜下检查每个平板,确保微滴定板的孔细胞长度相等。这个测试的目的是确定实验误差

第2天

孵育24小时后,向每个孔中加入100微升含有适当浓度样品提取物、阴性对照、阳性对照或溶剂(空白)的处理介质。试验或阳性对照的浸出液应至少有4个浓度,最高浓度应为100%浸出液,其他浓度可在单对数区间范围内适当浓缩。阴性对照应仅检测100%提取物,培养基应作为空白。细胞培养24小时(5% CO2,37℃,湿度> 90%)

第3天

24h处置后在相差显微镜下检查我们每个板,判定以及细胞进行接种管理系统设计误差和对照与试验组细胞的生长环境特性。记录分析试验研究样品浸提液细胞产生毒性影响作用从而导致的细胞通过形态学处理方面的改变,但这些数据记录不用于其他任何组织细胞具有毒性定量方法测定。对照细胞的不良社会生长发展特性可表明实验操作误差,并且企业可能会出现因此没有放弃该试验采用平板检查后小心移除培养基,这是作为一个非常重要工作步骤,因为浸提液中的化学还原剂也会还原MTT,导致假阴性预测结果。将50μLMTT溶液(见C.2.2.4.3)加到每一试验孔中,平板在37℃培养箱中再孵育2h。然后弃去MTT溶液,每孔加入100滴定板光度计上测定吸光度(参照波长650nm)。A1异丙醇溶液。震荡平板,置于配置570nm滤光片的微孔

数据分析

活细胞数减少从而导致了样品中代谢功能活性可以降低,这直接与生成的蓝紫色甲臢量有关,在570nm测量光密度。按式(C.1)与空白等式问题比较分析计算企业存活率明显下降

100×OD存活率(%)

ODs——试验研究样品100%浸提液光密度分析平均值;

平均OD5空白光密度

当存活率低时,测试样品的潜在细胞毒性高

如果细胞存活率降低到空白细胞的70% 以下,则存在潜在的细胞毒性。试验样品50% 提取物的成活率应至少与100% 提取物相同或更高,否则应重复试验。

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