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发光细菌的急性毒性试验

浏览次数:71|来源:飞凡检测 | 2020-11-23 11:25:32
  发光细菌法常用来做水质检测、水质急性毒性检测、发光细菌法等。跟着环境的变化,水污染问题也越来越严峻了,为了有效的环境监测办法,这些办法可以划分为两类:剖析技能和生物监测。发光细菌法作为新型生物毒性监测技能法,可适用于工业废水、污水体及实验室条件下可溶性化学物质的水质等急性毒性监测。
  本办法提供的是淡水型发光菌,它无需3%的NaCl即可正常成长和发光,故而关于一般水体或污染物的检测有其自身的优点。对一般化学品,可制造恰当浓度的水溶液进行检测。

  该淡水发光细菌在洁净水体中发光稳定,当遭到污染毒物影响时,发光遭到抑制,受抑制的程度与水体中毒物的总体浓度相关,故可以用生物与化学发光光度计测定其发光强度,评估该水样的毒性。而毒性巨细可按本办法规定的办法表征为参比物苯酚的浓度(mg/L),或EC50值(能产生抑光率为50%的受测样品的百分浓度。对化学品而言,则为mg/L)。

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  样品的准备
  1.水样的收集与保存
  水样收集用预先洗净枯燥的500ml广口瓶,一般距水面10-15cm处取样,并装满水瓶,立即用胶带封口。记载水样称号、地点、时刻等项目。应在收集后6h内进行毒性测定。如需保存,样品应置于4℃冰箱内,最多不超越12h。成果陈述中应说明收集时刻和测定时刻。从收集到测定不得超越12h。
  2.样品处理
  (1)水样的预处理
  (2)化学品的预处理
  (3)固体废物或污泥样品的预处理
  3.仪器设备
  ①生物化学发光光度计:原②微量加液器:③移液管:④容量瓶:⑤旋涡混合器。
  ⑥摇床。
  4.菌种和试剂
  (1)菌种
  青海弧菌Q67(VibtzoqinghaiensisQ67)冻干粉剂。封存于安瓿中,每安瓿管0.5g,有效保存期6个月(-18℃或更低)。当按本办法之规定将冻干粉复苏后5min即可康复发光,在暗室中肉眼应可见其发出的幽幽绿光。经适当稀释后,可用于检测。
  (2)试剂
  氯化钠 (NaCl),化学纯。乳糖,剖析纯。
  ①0.8%氯化钠溶液:氯化钠8g溶于1000mg/L蒸馏水中。保存于4℃,一周内可用。
  ②10%乳糖 溶液:乳糖100g溶于1000ml蒸馏水中,当天制造使用。
  (3)参比物
  苯酚,剖析纯。
  ①苯酚母液1000mg/L:②苯酚标准溶液20,40,80,100,120,160,200,250,300mg/L:
  实验程序
  (1)发光测定的环境条件
  室温,18-30℃均可进行,但测试过程中要求温度动摇在±1℃内。
  (2)测定过程
  1)淡水发光菌冻干粉的菌体复苏:将冻干粉安瓶及复苏液(0.8%的氯化钠)先置于4℃冰箱内约10-15min,然后将该复苏液lml注入安瓶内,置于旋涡混合器上使之充沛混匀、溶化,数分钟后在暗室中肉眼应见绿色荧光。若无绿色荧光,则不能使用。将该菌液倾倒于一洁净试管内,再以lml复苏液注入安瓶,振动后再倾入试管内,再次在旋涡混合器上充沛振动混匀。一般每安瓶可加复苏液5-6m1,肉眼检视应为乳白色均匀液体,静置后无沉淀即可应用。
  2)样品抑光程度的检测:
  3)样品的EC50值的检测:
  数据与陈述
  (1)数据处理
  相对发光强度(L)和抑光率(I)的计算:
  L(%)=样品发光强度/对照发光强度×100%
  I(%)=对照发光强度一样品发光强度/对照发光强度×100%
  (2)EC50值
  EC50是指受试物对发光菌效果后,发光强度下降为对照组的50%时(即相对发光强度为50%或抑光率到达50%时)之受试物浓度。当受试物为水样时,以稀释度(百分浓度)为单位;当受试物为化学品时,以mg/L为单位。EC50值越小,标明受试物的毒性越大。例如关于水样,A样品的EC50=76.5%,标明该样品的稀释度为76.5%时抑光率是50%,B样品的EC50=26.5%,标明B样品的稀释度为26.5%时的抑光率是50%。A样品与B样品相比,明显B样品要比A样品的毒性大,由于到达相同的抑(50%)时,B样品的浓度更低。
  关于化学品,假设A样品的EC50=0.lmg/L,B样品的EC50=10mg/L,明显A样品的毒性大于B样品,由于同样抑制发光菌50%的发光,A样品的浓度更小。
  样品毒性表达
  ①用苯酚浓度标明:当未经稀释的样品(即样品稀释度为100%)的抑光率在5%-95%时,也即相对发光强度在95%-5%范围内,可以用相同抑光率时苯酚的浓度来标明样品的毒性。大多数水样均在此范围内。
  ②用EC50值标明:对水样而言,在样品毒性甚大时,即100%浓度的样品其抑光率大于95%甚至使细菌发光完全碎灭时,必须将样品稀释若干倍之后才能进行检测,然后用抑制50%的发光量时该样品的稀释百分浓度来标明样品的毒性。明显稀释百分度越小,毒性越大。一般实测成果不能直接取得EC50值时,可将所测的样品系列浓度(%)与对应的抑光率作图,再通过图上查对50%抑光率所对应的样品百分浓度,即可求得EC50值。
  对化学品,EC50值用mg/L的浓度值来标明。明显,EC50值越小,毒性越大。
  ③毒性表达办法还应注明样品与发光细菌效果的时刻,由于效果时刻也影响数值巨细。如效果15min就与效果20min的数值不同,故还必须标明效果的时刻。一般可在数值表达后用括号加注效果时刻,例:EC50=0.10%(15min),或抑光率45%(15min),标明是效果15min时实测数据。本办法建议采用15min的效果时刻。
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