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重组蛋白原核表达服务

浏览次数:20|来源:飞凡检测 | 2021-11-09 14:19:30

飞凡一直致力于重组蛋白表达与制备研究。我们的科学家拥有丰富的原核蛋白表达以及工业级别蛋白发酵、纯化经验。通过每年多达400个原核蛋白制备项目的技术积累,我们设计了一套有效的包含多种融合标签(His,GST,SUMO,FLAG等标签)的表达载体,能够为客户可溶性表达超过150kDa分子量的重组蛋白;同时我们收集与建立了多种表达菌株(包括低温诱导表达菌株,10-16℃超低温诱导表达蛋白),以保证每一个重组蛋白制备的品质,为客户提供优质的服务。

大肠杆菌(E.coli)重组蛋白表达技术经过多年的发展,已经变得日趋成熟。但想要在大肠杆菌表达体系获得较高水平的可溶性以及高产量的蛋白表达,尤其是针对大分子蛋白和某些药物类蛋白,一个优质的表达策略必不可少。客户只需要提供我们一段蛋白序列,CDS或蛋白名称,我们富有经验的科学家均可以为您在较短的时间内制定一个完整的蛋白表达和纯化方案。常见的小分子(分子量<10 kDa)蛋白类药物,如Leptin,利拉鲁肽,EGF等在原核表达过程中以亲和标签+融合蛋白形式进行表达,发酵和纯化。此类蛋白的难点在于蛋白均以包涵体的形式进行表达,后期需要进行工艺繁琐的蛋白变复性处理。

重组蛋白的高效率表达,通常会涉及以下几个方面:

宿主体系选择

蛋白需求不同,那么表达宿主体系也不尽相同。原核表达体系常用的宿主为大肠杆菌和枯草杆菌,前者表达量高,后期产品需要去除内毒素;后者蛋白产量相对较低,但不产生内毒素。重组蛋白大肠杆菌表达常采用BL21(DE3)和K-12衍生菌株作为表达宿主与枯草杆菌作为表达菌株的主要区别如下所示:

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表达质粒体系选择

目前常用的重组蛋白表达质粒载体融合了复制子(Replicon)、启动子(promoter)、筛选标签(selection marker)、多克隆位点(MCS)和融合蛋白移除策略(fusion tag removal strategy),如图所示:

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飞凡的科学家通过改造pET载体,获得双表达质粒(BiPlasmid vector),该质粒含有双MCS位点,双T7启动子,双lac操纵子和双核糖体结合位点,利用该质粒我们可以为客户进行一次转染操作,而获得两种蛋白的独立表达。同时我们构建了含有低温诱导蛋白表达元件的pCold系列载体,该载体能够在16℃条件下经过IPTG诱导表达大分子量蛋白,如上清表达150kDa活性蛋白。

融合标签选择

亲和标签蛋白重组表达过程中采用亲和标签融合表达有两方面的作用:一方面是为了使蛋白纯化过程变得更加容易;另一方面是为了促进某些不溶性蛋白可溶。蛋白标签可分两类:一类是短肽类标签;一类是长肽以融合蛋白(fused partner)形式共表达。使用不同的蛋白标签需要根据具体案例来分析,卡梅德生物总结了常用的一些蛋白标签性质,如表1所示。

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蛋白重组表达策略组合

重组蛋白的表达往往不像理论那样一帆风顺,在实际的表达过程中有可能产生各种各样的问题。在选择一个蛋白表达策略困难的情况下,那么采用看似笨拙的方法,有可能会成为一种意想不到的“成功捷径”,比如项目要求构建表达两种重组蛋白时,构建6种不同的表达质粒,意味着有36种不同的表达条件组合,通过高通量微量蛋白表达实验一次性就可获得蛋白表达条件组合,后续中式飞行试验和成本控制会变得相对容易。

蛋白原核重组表达服务具体流程

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