飞凡标准技术服务(苏州)有限公司致力于打造国内专业的第三方检测服务公司
欢迎拨打检测热线 400-805-0463


飞凡标准技术服务(苏州)有限公司

400-805-0463


基于Edman降解的蛋白N端序列分析

浏览次数:25|来源:飞凡检测 | 2021-11-18 15:38:40

表达纯化后的蛋白产物,特别是蛋白品的分析过程中,需要对蛋白的末端进行验证,以保证表达纯化产物的N端和C端序列准确。Edman降解法是蛋白的N端序列分析中非常成熟的方法之一,有着广泛的应用。飞凡检测采用岛津公司Edman测序系统,为广大科研工作者和科研客户提供纯化后蛋白产物、抗体以及蛋白疫苗的N端测序服务。采用我们的测序系统,可以测定N端30个氨基酸的序列信息。采用特定的蛋白上样系统,可以测定N端的60-70个氨基酸。飞凡检测也建立了以先进的LC-MS/MS技术进行N-端测序的平台,可以测出封闭和修饰的蛋白质末端,与Edman降解法形成互补,保证N端测序服务的顺利进行。

在蛋白质测序前,蛋白样品首先经过SDS-PAGE的分离,保证样品的纯度满足测序的要求;随后将SDS-PAGE上的蛋白样品转移到PVDF膜上;经过染色确定把蛋白条带并切出;使用Edman测序仪对得到的PVDF膜上的蛋白样品进行分析。Edman降解测序是通过循环反应从蛋白质的N端开始逐个鉴定氨基酸的种类,从而对蛋白质的N端序列进行测定。每一个Edman测序反应包括3步:第一步是在碱性条件下,PITC与蛋白N端的游离氨基结合;第二步是在酸性溶液中,N端残基被切除;第三步是PITC结合的残基转化成为更为稳定的PTH残基,经过在线的HPLC分析,根据洗脱时间确定氨基酸种类。

@]_}3}RJBG8WMGYB$2PCA$9.png

基于Edman降解的蛋白质N端测序服务流程

V0L1P`@~~@M][8Z]~6LY)L4.png

应用领域

• 蛋白表达产物的验证:重组蛋白插入位点和表达顺序是否正确;
• 细胞株建立和发酵过程中蛋白产物的验证:验证细胞株建立和发酵过程中蛋白产物N端甲硫氨酸和信号肽是否正确处理;
• 蛋白降解/酶切分析:对降解/酶切形成的新蛋白片段N端进行分析,确定断裂/酶切位点;
• De-novo测序:对于蛋白数据库中不存在的全新蛋白序列进行分析。

关于样品

PVDF膜类样品的准备过程

1.样品电泳和电转
a. 对蛋白样品进行1D或者2D跑胶
b. 将蛋白胶上的样品转移至PVDF膜上;注意:千万不要使用硝酸纤维素膜(Nitrocellulose membranes)
c. 在此过程中请佩戴手套和头套,避免自身角蛋白对测序结果的影响

2.PVDF膜的染色
a. 染色过程中可以使用考马斯亮蓝或者立春红对PVDF膜进行染色;注意:千万不要使用银染的方法进行染色
b. 染色完成之后,可以使用双蒸水对PVDF膜进行清洗
c. 如果转膜的缓冲液中含有甘氨酸,需要对PVDF膜进行多次冲洗,以避免甘氨酸对后续分析的影响
d. 更详细的样品准备步骤,见Edman测序样品准备Protocol

3.靶蛋白条带获取
a. PVDF膜染色后,靶条带清晰可见,用洁净的解剖刀将靶蛋白条带切下
b. 在蛋白量允许的情况下,可以准备2-3条靶条带以增加靶蛋白的量

4.样品运输
对切下的蛋白条带进行密闭包装,使用冰袋运输即可

溶液样品的准备过程

1.蛋白的纯度和用量
a. 样品需要量在1-10 ug
b. 样品纯度要>90%
c. Buffer中不要使用表面活性剂,并尽可能降低溶液的盐浓度
d. Tris, glycine, guanidine, glycerol, sucrose, ethanolamine, SDS, Triton, X-100, Tween和其他的去垢剂,ammonium sulfate和其他的铵盐均会对后续的氨基酸鉴定产生影响,在样品准备过程中要避免使用
e. 样品准备过程全程佩戴口罩和头套,避免角蛋白的影响

2.蛋白样品的运输
a. 液体样品推荐干冰运输
b. 液体样品也可以在冷冻抽干或者真空抽干后,使用冰袋运输

飞凡检测质检报告流程:


  • 1、 提供产品资料

  • 2、 工程师根据您的产品推荐合适检测项目,并给出报价

  • 3、 确认报价没有问题,然后把样品送到我们实验室

  • 4、 支付检测费用,安排检测

  • 5、检测完成,出具检测报告,邮寄给客户

  • 咨询热线:18018131362

  • 关于飞凡


  • 000_23.jpg


飞凡检测致力于打造国内专业的第三方检测服务公司,不断优化整合市场检测资源,飞凡检测与多家科研院所,如上海同济大学,苏州大学,SGS,TUV,以及国内众多知名的检测公司进行深度合作,共同为国内制造业服务,为中国的制造业开拓海外市场保驾护航,为我们日常生活的健康安全树立标杆;公司目前工程师百余人,95%以上是本科以上学历;我们合作的实验室通过CNAS,CMA(EZ),所出具的任何一张报告都有CNAS,CMA资质,确保出具的每份报告都具有权威的法律效力。


  • 为什么选择我们

  • 市场需求和成熟的模式给了我们成功的保证


  • 000_25.jpg


  • 000_27.jpg



本文连接:https://www.feifan-sz.cn/products_276/1211.html



相关文章


下一篇:GeoChip 功能基因芯片
上一篇:StressChip功能基因芯片

此文关键词:基于Edman降解的蛋白N端序列分析